不結球白菜生長發(fā)育過程中表型變化作者：Lauri Nikkanen, Anita Santana Sánchez, Maria Ermakova, Matthias R?gner, Laurent Cournac, Yagut Allahverdiyeva
時間：2020年1月9日
雜志：BioRxiv生物學預印本
標題：Functional redundancy and crosstalk between flavodiiron proteins and NDH-1 in Synechocystis sp. PCC 6803
研究背景：
光合生物具有不同的調控機制來應對環(huán)境條件快速變化，以保護光合機構免于損傷。波動光強可能會導致光合電子傳遞鏈（PETC），特別是光系統(tǒng)（PSI）的過度還原，從而給光系統(tǒng)帶來損傷風險。為了解決這個問題，藍細菌、藻類和植物（不包括被子植物）使用C型黃酮二鐵蛋白（FDP）作為強大的光保護電子庫，將多余的光合電子從PSI下游引導至O2。該過程稱為類似Mehler的反應，但與Mehler反應相反，它不會產(chǎn)生有害的活性氧（ROS）。
β-藍藻（集胞藻屬PCC 6803，下文簡稱集胞藻）的基因組，編碼四種FDP亞型，即Flv1-4，它們以Flv1和Flv3或Flv2和Flv4組成的雜合低聚物在O2光還原中起主要的作用。本文作者之前的研究表明，在空氣CO2水平下，F(xiàn)lv1/3和Flv2/4雜聚物以協(xié)調和相互依賴的方式起作用：Flv1/3在照光開始時或在光強變強時刺激強烈的但短暫的O2光還原。Flv2/4雜聚物催化O2的穩(wěn)態(tài)還原，速率緩慢且催化能力弱，但也可以消耗PSI下游的電子。在堿性條件下（pH為9）的高濃度CO2和空氣CO2濃度中，編碼Flv2，F(xiàn)lv4和Sll0218蛋白的flv4-flv2操縱子被下調。盡管如此，在高濃度的CO2中，F(xiàn)lv1/3的低水平會刺激強烈的穩(wěn)態(tài)O2光還原，而在pH為9的空氣CO2中，F(xiàn)lv1/3只負責強烈但短暫的O2光還原。體外實驗表明重組Flv1，F(xiàn)lv3和Flv4的同型寡聚體可以通過NADH和/或NADPH還原O2，但FNR和還原態(tài)Fd是否是FDP的可能供體，尚未被證明。此外，與體外實驗相反，單獨過表達Flv1或Flv3的集胞藻突變體的研究清楚地表明， Flv3或Flv1的同型低聚物不參與體內O2的光還原。因此，體內FDPs的電子供體仍有待闡明。
在藍藻中，光合作用和呼吸電子轉移反應共存于類囊體膜上，并且相互錯綜復雜地聯(lián)系在一起，需要進行嚴格的調控。NAD(P)H脫氫酶復合物1（NDH-1，光合復合物I）主要分布于類囊體膜中，參與多種生物能量反應，包括PSI周圍的循環(huán)電子傳遞（CET），呼吸和通過碳濃縮機制(CCM)獲得CO2。NDH-1復合物以幾種形式存在，具有不同的生理作用：NDH-11型以NDHD1和NDHF1亞基為特征，并作為呼吸電子傳遞鏈的復合物I發(fā)揮功能；NDH-12則為NdhD2亞基，目前尚不清楚NDH-11和NDH-12是否具有不同的生理功能。NDH-13和NDH-14形式分別包括低Ci誘導的高親和力CO2獲取亞基NdhD3、NdhF3、CuPA和CUPS，或分別構成的低親和力CO2獲取亞基NdhD4、NdhF4和CuPB，在CO2到HCO3-(O)的轉化中起作用。這一過程可能是由NDH-1質子泵在類囊體膜上產(chǎn)生堿性口袋實現(xiàn)的。所有四種NDH-1類型都催化CET從鐵氧還蛋白(FD)到質體醌(PQ)，這與4H+/2e-泵入類囊體腔有關。然而，對于NDH-13,4，功能要弱于NDH-11,2。
在本研究中，我們旨在闡明FDPS和NDH-1介導的電子傳遞通路如何在可變光照和Ci-濃度變化下，在Calvin-Benson-Bassham循環(huán)(CBB)中協(xié)同維持PETC、呼吸、CCM和CO2固定之間的氧化還原平衡。為此，我們采用生物物理和生物化學方法對同時存在FDP和NDH-1途徑缺陷的集胞藻突變株進行了研究。我們的結果為Flv1/3或NDH-11,2的存在提供了令人信服的證據(jù)，但不是NDH-13,4，需要說明的是NDH-13,4對于集胞藻在從高濃度CO2條件過渡到空氣CO2和強光的聯(lián)合脅迫條件下的生存是必不可少的。我們證明Flv1/3和NDH-11,2的動態(tài)協(xié)調和協(xié)同作用是集胞藻細胞光合結構光保護所必需的，并討論了其中涉及的分子機制。
實驗設計：
使用了耐葡萄糖的野生Synechocystis sp PCC 6803，單突變株Δflv1和Δflv3, M55突變株（ΔndhB）, 雙突變體Δd1d2和Δd3d4和三突變體Δflv1d1d2, Δflv3d1d2, Δflv1d3d4和Δflv3d3d4。所有突變體均顯示出完全分離。實驗前的培養(yǎng)物以30ml分批培養(yǎng)在pH 7.5的BG-11培養(yǎng)基中，其他培養(yǎng)條件CO2為3％，溫度30℃，中等光強（ML）50 μmolm-2s-1連續(xù)白光。突變的預培養(yǎng)物補充有適當?shù)目股亍Ｔ趯?shù)生長期，將細胞收獲并重懸于新鮮的不含抗生素的BG-11中，OD750為0.1–0.2。然后將細胞轉移到空氣[CO2] / 30℃，并用50或220μmolm-2s-1的白光連續(xù)照射。
測量參數(shù)：
氣體交換，熒光和差示吸收（Y(ND), Y(NA), Y(I)），近紅外光譜吸收，77K熒光，NADPH，ECS, 蛋白質提取及免疫印跡, 波動光響應。
使用儀器：
DUAL-PAM-100，DUAL-KLAS-NIR, 9-AA/NADPH等
部分實驗結果：
通過對單個FDP突變體（Δflv1和Δflv3）和雙重NDH-1突變體（Δd1d2，其中NDH-11,2和Δd3d4缺乏，NDH-13,4），以及三重突變體（缺少Flv1或Flv3以及NDH-11,2或NDH-13,4之一）的研究表明，F(xiàn)lv1 / 3或NDH-11,2的存在對于生長條件從高CO2 /中等光照到低CO2 /高光照變化的生存是必不可少的。另外，在研究條件下，F(xiàn)DP和NDH-11,2之間存在功能冗余和串擾，并表明FDP和NDH-11,2的功能是動態(tài)協(xié)調的，以有效地氧化PSI，并在可變的CO2和波動光下進行光保護。
圖1 WT和突變體在不同實驗條件下的生長情況
所有的實驗培養(yǎng)都是從預培養(yǎng)開始，調整到OD750=0.1。(A)細胞在3%[CO2]/中等光照(ML 50μmolm-2s-1)中預培養(yǎng)，調節(jié)OD750=0.1，在相同條件下生長。(B)細胞在3%[CO2]/中等光照下預培養(yǎng)，然后轉移到空氣[CO2]/中等光照中。(C)細胞在空氣[CO2]/ML中預培養(yǎng)，然后轉移到空氣[CO2]/高光照中(HL 220μmolm-2s-1)。(D)細胞在3%[CO2]/ 中等光照下預培養(yǎng)，然后轉移到空氣[CO2]/ 高光照中。A-D中顯示的值是三個獨立的生物重復±SE的平均值。(E)WT細胞和突變細胞在含有BG-11的瓊脂平板上生長的結果。收集生長在3%[CO2]/ML下的細胞，以10倍梯度稀釋后點到BG-11瓊脂平板上，從OD750=1開始，分別在空氣[CO2]/ML和空氣[CO2]/HL下孵育7d。更多結果參考補充數(shù)據(jù)S1.
圖2 WT和突變體的O2和CO2交換率
細胞在空氣[CO2]/ML中培養(yǎng)4天后收獲細胞，用新鮮的BG-11調節(jié)Chla濃度至10μg·ml-1。暗適應15min，用500μmolm-2s-1的白光照射5min，用膜進樣質譜計監(jiān)測氣體交換情況。在測量之前，樣品添加了與16O2濃度相同的18O2，以區(qū)分O2的攝取和放氧，并添加了1.5 mM的NaHCO3。每組的虛線表示CO2固定的補償點(攝取速率等于呼吸速率)。實驗設置了三個獨立的生物重復，給出了具有代表性的測量結果。
圖3 WT和突變體在不同光強下的光合參數(shù)
(A) PSI的受體側限，Y(NA)，(B)PSI的供體側限，Y(ND)，以及(C)PSI的有效產(chǎn)率，Y(I)根據(jù)在875-830 nm處的差示吸收變化計算。葉綠素a熒光變化與PSI氧化還原變化同步測量，用于計算(D)PSII的有效產(chǎn)率。細胞在空氣中培養(yǎng)4d后收獲細胞，用新鮮BG-11調節(jié)Chla濃度至10μg ml-1。將細胞暗適應10min，然后用紅色光化光強度在25和530μmolm-2s-1之間交替照射1min。每15秒提供飽和脈沖(Width: 500ms, Int.: 5000μmolm-2s-1)。所顯示的值是3-4個獨立生物重復±SE的平均值。
圖4 WT和突變體在波動光下的NADPH和Chl a熒光
WT(A)、Δflv3(B)、Δd1d2(C)和Δflv3 d1d2細胞(D)在空氣[CO2]/ML中培養(yǎng)4d后，收集細胞，用新鮮BG-11調節(jié)Chla濃度至5μg ml-1。暗適應10min后，用25/530μmolm-2s-1的交替紅光照射1min。用Dual-PAM 100雙通道葉綠素熒光儀及其9-AA/NADPH附件模塊監(jiān)測NADPH氧化還原變化，方法是測量365 nm激發(fā)引起的420至580 nm之間的熒光變化。同時記錄葉綠素a熒光。(E)暗適應細胞在530μmolm-2s-1照射過程中，NADPH氧化還原發(fā)生變化。其他實驗細節(jié)如A-D所示。(F)顯示(E)中照明的前2秒的放大結果。這些值分別根據(jù)在照明開始和停止時的最小和最大熒光變化來歸一化。用三個獨立的生物重復進行了實驗，其中顯示了具有代表性的測量結果。RU。=相對單位。
圖5 黑暗到HL轉變過程中PC、P700和FD的氧化還原變化，以及pmf的建立
將wt(A)、Δflv3(B)、Δd1d2(C)和Δflv3 d1d2(D)暗適應10min，然后用DUAL-KLAS-NIR四通道近紅外光譜儀測量在503μmolm-2s-1紅光照射30s期間，在780-800 nm，820-870 nm，840-965 nm和870-965 nm處吸光度的差異變化。使用為本研究確定的差分模型曲線圖(DMPS)將PC、P700和Fd信號從吸光度差異變化中去卷積(圖S3)。A-D中的上圖顯示了下圖前1.5秒照光過程的放大結果。實驗設置了三個獨立的生物重復，其中顯示了具有代表性的測量結果。另請參閱補充圖S3。(E)從暗到500μmolm-2s-1的綠色光化光的過渡過程中pmf的積累。用JTS-10型光譜儀測量了500-480 nm(ECS)的吸光度差，根據(jù)ECS信號的暗間隔弛豫動力學(DIRK)測定了光誘導的pmf。給出了3-4個獨立實驗的平均值±SEM。小插圖顯示照明1s后的pmf值，以獲得更清晰的視圖。(F) 如(E)，在光照1s和30s后的類囊體膜質子導度(gH+)。gH+是通過ECS信號在第一次光照后衰減動力學時間常數(shù)的倒數(shù)來計算的。(G)類囊體質子通量(vH+)，以pmf×gH+計算。(H)500-480 nm吸光度差的代表性結果，用于測量E中的結果以及在光照30秒后的500 ms暗間隔期間ECS衰減動力學的值(下圖)。擬合曲線顯示為綠色。在空氣[CO2]/ML中生長4d后收獲細胞，用新鮮BG-11調節(jié)Chla濃度至10 μg ml-1(A-D)，7.5μg ml-1(E-J)。
圖6 WT和突變體光合作用和CCM相關蛋白的免疫印跡檢測和77K熒光發(fā)射光譜
預培養(yǎng)在3%[CO2]/ML下培養(yǎng)3天，然后收獲，再懸浮在OD750=0.15新鮮的BG-11中，(A)在空氣[CO2]/ML中培養(yǎng)24小時，(B)在空氣[CO2]/ML中培養(yǎng)4天，收獲后再懸浮在OD750=0.15的BG-11中，然后在空氣[CO2]/ML中培養(yǎng)24小時。(C)在空氣[CO2]/HL中孵育24小時。用SDS-PAGE分離總蛋白提取物，并用特異性抗體進行檢測。所示的免疫印跡代表2-3個獨立的生物學重復。(D)完整的WT和ΔFlv3d1d2細胞在空氣[CO2]/ML中生長4天的77K熒光發(fā)射光譜。(E)在3%[CO2]/ML中預培養(yǎng)生長后收獲，再懸浮在OD750=0.15的新鮮BG-11中，在空氣[CO2]/HL中孵育24小時。將細胞(D和E)收獲，調節(jié)到Chla為7.5μg ml-1，在77K用440 nm光激發(fā)。將光譜歸一化為685 nm處的PSII熒光峰。
圖7 協(xié)調FDPs和NDH-1的活性以防止PSI過度還原的模型示意圖
(A)在Fd庫大量還原而PQ庫沒有還原的條件下，NDH-1L將電子從Fd轉移到PQ池，同時通過類囊體局部RTOs還原O2。NDH-1L將2H+/e-泵入管腔，而FDP和RTO在類囊體液面將O2還原為H2O時消耗H+。這增加了跨類囊體pmf，而pmf反過來推動ATP合成，抑制Cytb6f處的PQH2氧化，從而防止進一步向PSI提供過多的電子。NDH1-MS的碳酸酐酶活性將HCO3-轉化為CO2，消耗胞質中的H+，可能還耦合了H+到管腔的轉運，進一步增加了pmf。CO2利用率和ATP/NADPH比值的增加提高了CBB在PETC受體側的電子吸收能力。(B)如果PQ庫被高度還原，F(xiàn)d庫被氧化，并且pmf很高，則假設NDH-1L可以起相反的作用，通過從管腔釋放2H+/e-來將電子從PQH2轉移到Fd+。由Flv1/3催化的強Mehler式反應在此時就非常有必要，以維持足夠的氧化態(tài)Fd庫，F(xiàn)lv1/3可能直接接受來自Fd-的電子。(A)中所述的大部分成分在(B)中被省略，以提高清晰度，而不是暗示它們不存在。PQ/PQH2和Fd的顏色填充范圍表示還原的水平。
由于相關研究內容非常專業(yè)，難免有些理解不準確或者編輯整理的疏漏，請以英文原文為準。
Nikkanen L E, Sanchez A I S, Ermakova M, et al. Functional redundancy and crosstalk between flavodiiron proteins and NDH-1 in Synechocystis sp. PCC 6803. bioRxiv, 2020: 2019.12. 23.886929.