不結(jié)球白菜生長發(fā)育過程中表型變化雙單倍體（Doubled Haploid）育種，簡稱DH育種，是利用誘導(dǎo)系誘導(dǎo)（或花藥離體培養(yǎng)等手段誘導(dǎo)）產(chǎn)生單倍體植株，再通過染色體組加倍（自然加倍或藥劑處理）使植物恢復(fù)正常染色體數(shù)的育種方法。DH育種能夠在較短時間（2代）內(nèi)便可以選育出DH純系，大大縮短育種年限，是加速種質(zhì)材料純化、縮短育種年限的有效途徑，是現(xiàn)代生物技術(shù)育種的主要支柱技術(shù)之一。
由于自然單性生殖或孤雄生殖單倍體非常罕見，因此單倍體的獲得成為單倍體育種的一個難點，游離小孢子培養(yǎng)是獲得單倍體的重要手段之一。植物游離小孢子培養(yǎng)受外植體預(yù)處理、小孢子預(yù)處理、供體基因型、小孢子培養(yǎng)密度、培養(yǎng)基pH值和培養(yǎng)基成分等因素的共同影響，因此無法形成通用的誘導(dǎo)策略，需要從花芽選取、小孢子胚誘導(dǎo)、二倍體化等各個環(huán)節(jié)進行不斷的調(diào)整和改善，才能構(gòu)建一種植物優(yōu)選的游離小孢子培養(yǎng)體系。
本文利用Ampha Z32花粉活力分析儀（阻抗流式細胞技術(shù)，IFC）進行了系列測試，以期幫助廣大科研用戶構(gòu)建優(yōu)選的游離小孢子培養(yǎng)體系，提高游離小孢子的培養(yǎng)效率：1）確定小孢子各發(fā)育階段的相位角-振幅散點圖，并歸納發(fā)育變化軌跡；2）確定培養(yǎng)開始前和整個培養(yǎng)過程中小孢子的活力；3）估算小孢子的密度；4）監(jiān)測小孢子對誘導(dǎo)策略和培養(yǎng)條件的響應(yīng)，進行產(chǎn)胚率的早期預(yù)測。
—— 小孢子發(fā)育階段 ——
小孢子發(fā)育時期是影響小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素之一，選擇合適的花粉發(fā)育時期可極大的提高植株小孢子胚狀體發(fā)生的誘導(dǎo)效率。大量研究表明，通常小孢子培養(yǎng)的最佳時期是單核晚期（單核靠邊期）和雙核早期，這可能是由于單核靠邊期的小孢子處于面臨不同分裂方式和發(fā)育途徑的敏感時期，更容易誘導(dǎo)成功。因此，準確判斷并選擇最適時期的小孢子進行培養(yǎng)，是提高產(chǎn)胚量的基本保障。
傳統(tǒng)上進行小孢子發(fā)育階段的鑒定是通過染色鏡檢法，即用DAPI或乙酰胭脂紅對采自不同大小花蕾或穗的小孢子進行染色，然后顯微鏡觀察細胞核的數(shù)目和形態(tài)，并計數(shù)以確定各發(fā)育階段細胞所占的比例，此過程極其費時、耗力。
由于處于不同發(fā)育階段的小孢子的體積、細胞質(zhì)和細胞膜的特性不同，Ampha Z32花粉活力分析儀所檢測到的電阻抗信號也就不同，由此而生成的相位角（X-相對活性）-振幅（Y-相對大?。┥Ⅻc圖不同，所形成的散點類群也不同。如圖1所示，小麥孢子發(fā)育過程散點圖的變化以及DAPI染色法確定的對應(yīng)發(fā)育階段。本測試使用AF6緩沖液從單個小穗的花藥中分離出小孢子，取極小的一部分進行DAPI染色，剩余部分經(jīng)過濾稀釋后用Ampha Z32花粉活力分析儀進行測量。
圖1 小麥孢子發(fā)育變化軌跡
我們測試了多種植物在不同發(fā)育階段的散點云圖，并對比了不同發(fā)育階段散點云變化，結(jié)果表明通過散點圖的變化軌跡均可以準確區(qū)分出小孢子的不同發(fā)育階段。如圖2所示，不同發(fā)育階段的散點顏色不同，三細胞花粉物種（西藍花、辣椒）成熟軌跡中的散點類群明顯多于二細胞花粉物種（水稻）。利用Ampha Soft軟件的統(tǒng)計分析功能，我們可以量化每個顏色類群的散點數(shù)，即統(tǒng)計出每個發(fā)育階段的小孢子的數(shù)量及比例，幫助確定特定發(fā)育階段占比較高的花芽的大小或小穗所處的位置，如圖3所示。小孢子發(fā)育階段的準確判定，為小孢子供體的選擇帶來極大的便利，可極大的提高植株小孢子胚狀體發(fā)生的誘導(dǎo)頻率。
圖2 小孢子不同發(fā)育階段的散點云疊加圖
圖3 麥穗不同穗位的單核、雙核和三核小孢子的比例
盡管同一物種的花粉在發(fā)育的單核早期、單核晚期及成熟早期的相位角-振幅散點圖中具有相似的相位角，但振幅大小卻可能差異顯著，這是由于遺傳變異會影響小孢子的大小，因此我們建議根據(jù)基因型評估不同花粉的發(fā)育階段。
—— 小孢子的活力和密度 ——
小孢子的活力和密度亦是影響小孢子胚狀體產(chǎn)生的主要因素。本實驗利用Ampha Z32花粉活力分析儀對這兩個指標進行了測試，同時利用FDA染色法測試細胞活力，利用血球計數(shù)器進行細胞計數(shù)。
Ampha Z32花粉活力分析儀（Amphasys，瑞士），通過檢測流經(jīng)交流電場的花粉懸浮液中花粉的電阻抗信號，分析獲得花粉的數(shù)量、大小、活性，測量過程中確保懸浮液介質(zhì)電導(dǎo)率的穩(wěn)定對準確評估花粉活性是非常重要的。大量實驗表明，緩沖液（AmphaFluid）體積占比達到50-80%，才能較好的評估小孢子的活性，由于不同培養(yǎng)介質(zhì)的電導(dǎo)率不同，建議通過多次實驗確定小孢子培養(yǎng)液和緩沖液（AmphaFluid）的較優(yōu)體積比。移取精確體積的小孢子混合液后，在Ampha Z32花粉活力分析儀的計數(shù)模式下進行測量即可確定小孢子的準確濃度，并統(tǒng)計出活性小孢子的數(shù)量，整個測試過程不超過2min。
圖4 南瓜小孢子散點圖
—— 誘導(dǎo)成功率評估及產(chǎn)胚量的早期預(yù)測 ——
法國Vegenov研究所利用AmphaZ32花粉活力分析儀追蹤了小麥小孢子的發(fā)育過程（案例介紹：Ampha Z32在小麥孢子發(fā)育及產(chǎn)胚量早期預(yù)測中的應(yīng)用）。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)誘導(dǎo)處理后，大部分小麥小孢子在培養(yǎng)的幾天內(nèi)就停止了發(fā)育，只有一小部分活細胞能逐漸分裂成星形小孢子，最后形成有組織結(jié)構(gòu)的胚狀體。
Vegenov的研究發(fā)現(xiàn)，IFC信號隨小麥小孢子形態(tài)、細胞大小的變化而變化，結(jié)合顯微鏡鏡檢（圖5），可以準確匹配到小孢子發(fā)育的不同階段。從IFC信號所確定的相位角-振幅散點圖中可利用多邊形門控區(qū)分出處于不同發(fā)育狀態(tài)的小孢子類群，如圖6所示。其中小孢子經(jīng)過脅迫處理后（D0），相位角-振幅散點圖中出現(xiàn)的P2細胞類群為具有活性的小孢子群，后續(xù)實驗證明，這一類群反映了小麥小孢子對誘導(dǎo)處理的響應(yīng)，可幫助在小孢子培養(yǎng)前確定誘導(dǎo)處理的效果，提高胚狀體發(fā)生的成功率。而培養(yǎng)開始后出現(xiàn)的P3細胞類群，與花粉發(fā)育（配子體發(fā)育途徑）過程中發(fā)現(xiàn)的任何細胞類群都不重疊，這表明該類群是孢子體發(fā)育途徑中特有的細胞類群。培養(yǎng)過程中，該類群細胞數(shù)量逐漸減少，振幅和相位逐漸增大，說明部分小孢子在這一過程中死亡，而部分小孢子胚在不斷生長發(fā)育。此外，本實驗還以IFC測試數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，建立了預(yù)測胚胎產(chǎn)量的線性數(shù)學(xué)模型，統(tǒng)計分析表明，培養(yǎng)第7天P3類群的細胞數(shù)量可以準確預(yù)測30d后的胚胎產(chǎn)量（y=6.539x-20.827；R^2=0.9519，p <0.05）。
圖5 Pavon小麥配子體和孢子體途徑的發(fā)育階段
（A）單核小孢子；（B）雙核小孢子；（C）花粉粒；（D）星形小孢子（v為液泡）；（E）多核小孢子；（F）質(zhì)膜化小孢子
圖6 Pavon小麥配子體和孢子體途徑的發(fā)育階段（IFC法）
配子體途徑：ML：單核中晚期；EB：早期雙核；LB：單核晚期；ET：三核早期；LT：三核晚期。孢子體途徑：培養(yǎng)前21天、培養(yǎng)第0、1、5和7天的小孢子發(fā)育狀態(tài)。ML/D-21代表配子體發(fā)育和孢子體發(fā)育的共同階段，紅色垂直門控右側(cè)為活性細胞，藍色多邊形門控P1為雄核發(fā)育開始時的活性孢子群；綠色多邊形門控P2為脅迫處理后，孢子離體培養(yǎng)前（D0）的活性孢子群；紫色多邊形門控P3為離體培養(yǎng)1天后的活性孢子群。
以上結(jié)果表明，IFC法可以在DH育種過程中，幫助選擇小孢子植物供體，評估小孢子胚誘導(dǎo)策略，優(yōu)化培養(yǎng)條件，并在小孢子培養(yǎng)早期進行產(chǎn)胚量的準確預(yù)測，可顯著提高游離小孢子培養(yǎng)的成功率，進而加快DH育種的效率。
原文閱讀：Accelerating Doubled Haploid Plant Production
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